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人体自身抗体检测技术综述

时间:2019-07-04 17:00  点击: 次  来源:网络  作者:admin  评论:- 小 + 大

  摘    要: 自身抗体对于自身免疫性疾病的诊断、鉴别诊断、疗效观察及预后判断具有重要意义。近年来, 随着抗体筛选新技术的应用, 更多种类的自身抗体被发现, 其应用范围除自身免疫性疾病外, 已扩展至神经系统疾病、肿瘤、消化、生殖及移植等领域。目前, 自身抗体检测仍存在试剂参比溯源、检测过程一致性、结果同质互认等问题。制订试剂溯源及标准化操作规范将会引导自身抗体检测向自动化、微量化、智能化、高敏感、高通量的方向发展, 以便更好地为临床服务。

  关键词: 自身抗体; 标准化操作; 筛选技术; 展望;

  Abstract: Autoantibodies are very important for autoimmune disease to diagnosis, differential diagnosis, curative effect and prognosis.Recent years, with the application of the new antibody screening technology, a growing many kinds of autoantibodies were discovered, and the scope of its application has been expanded to nervous system disease, tumor, digestive and reproductive and other fields besides autoimmune disease.At present, there are many problems in autoantibody detection, such as the reagent cannot be compared with the source, the detection process is inconsistent, and the results cannot be homogenized.The development of guidelines for the traceability and standardization of reagents will guide to the direction of automation, micromation, intelligence, high sensitivity and high throughput, in order to serve for clinic better.

  Keyword: autoantibody; standardized operations; screening technology; prospects;

  自身抗体是指针对自身组织、器官、细胞、细胞亚结构、体内蛋白分子、体内核酸等所有自身抗原的抗体总称, 其本质为机体B细胞分泌的免疫球蛋白[1]。自身抗体分为生理性自身抗体 (或称天然自身抗体) (NAbs) 和病理性自身抗体 (PABs) 。有研究显示, 生理性自身抗体是维持机体处于健康状态的重要物质, 多为IgM型, 参与机体正常新陈代谢, 减少体内细胞凋亡物质的堆积[2]。当机体免疫调节功能受损时, 体内自身抗体大量产生, 多为IgG型, 与自身抗原亲和力高, 形成的免疫复合物通过FcγR激活炎性介质 (细胞因子) 或补体系统, 导致自身免疫性疾病的发生, 这种具有致病损伤作用的自身抗体即为病理性自身抗体, 即通常所称的自身抗体[3]。

  1、 自身抗体的种类

  自身抗体种类很多, 通常采用两种分类方法, 一种为以疾病为中心, 即相关自身抗体与该疾病有关, 该分类法对于临床医生自身抗体项目申请具有重要意义, 同时也有助于对该疾病与自身抗体的全面认识;另一种为以靶抗原为中心, 即其命名为抗靶抗原抗体, 这有助于对自身抗体性质的认识, 也有助于对自身抗体对靶向组织攻击造成机体损伤的理解。从理论上讲, 机体内存在多少种抗原, 就能产生多少种自身抗体, 因此, 自身抗体错综复杂, 种类可达成千上万种, 自身抗体的命名应尽量根据抗体所针对的抗原进行, 便于名称的统一。以靶抗原为中心的自身抗体分类见图1。

人体自身抗体检测技术综述

  1.1、 常规自身抗体

  随着自身免疫学科的发展及检验技术的逐渐普及, 自身抗体已成为大多数医疗机构的常规检测项目, 包括抗核抗体 (ANA) , 抗核抗体谱[包括抗DNA、抗组蛋白及抗可提取性核抗原 (ENA) 抗体谱等], 抗中性粒细胞胞浆抗体[包括抗蛋白酶3抗体 (抗PR3) 、抗髓过氧化酶抗体 (抗MPO) 等], 抗磷脂抗体 (包括抗心磷脂抗体、抗β2糖蛋白I抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体等) , 类风湿关节炎抗体 (包括抗CCP抗体、类风湿因子、抗角蛋白抗体等) , 自身免疫肝病抗体 (包括抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体、抗肝肾微粒体-1抗体等) , 肌炎相关抗体 (包括抗Mi-2、抗信号识别颗粒抗体、抗PM-Scl100等) , 糖尿病抗体 (包括谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛素抗体和胰岛细胞抗体等) 。其中ANA与抗核抗体谱是临床开展最为普遍的两类项目。ANA泛指抗各种核及胞浆抗原成分的一大类抗体, 推荐采用以HEp-2细胞为底物的间接免疫荧光法进行检测。而抗核抗体谱是指针对明确纯化抗原抗体的集合, 其与传统的ENA抗体谱有所不同, 传统ENA抗体谱检测通常采用磷酸盐缓冲液提取动物胸腺细胞核蛋白作为抗原底物[4]。但由于核成分中的DNA和组蛋白等碱性成分无法被磷酸盐缓冲液 (pH=7.2) 提取, 因此, 传统ENA抗体谱并未包括抗DNA抗体和组蛋白抗体等碱性靶抗原的抗体。

  随着蛋白重组技术的进步, 几乎所有蛋白分子均可重组合成, 目前临床上很少采用传统Western-blot法进行ENA抗体谱的检测, 从理论上讲, 合成纯化抗原检测结果准确可信, 且抗核抗体谱的检测范围远大于ENA抗体谱的范围。ENA抗体谱概念不再被使用, 因此, 采用大量重组蛋白的抗核抗体谱检测试剂盒在临床上已趋普及, 并被广大学者所接受。ANA荧光图型与抗核抗体谱靶抗原对应关系见图2。

  图1 以靶抗原为中心的自身抗体命名分类图

图1 以靶抗原为中心的自身抗体命名分类图

  1.2 、新型自身抗体

  随着蛋白重组及自身抗体筛选技术的发展, 大量新型自身抗体集中涌现, 其中主要包括传统自身免疫疾病发现的一些自身抗体, 另外在其他领域如神经系统疾病、肿瘤、生殖、消化系统疾病等也出现了一些新型自身抗体, 为其应用拓展了范围。肿瘤患者自身抗体反应通常与肿瘤组织或血清中的肿瘤相关抗原 (TAA) 的异常或过度表达相关, 大部分的肿瘤自身抗体都是由TAA诱导产生的, 为肿瘤的诊断和鉴别诊断提供了新的实验依据。近年来出现的新型自身抗体见表1。

  图2 ANA荧光图型与抗核抗体谱靶抗原对应关系

图2 ANA荧光图型与抗核抗体谱靶抗原对应关系

  表1 近年来出现的新型自身抗体

表1 近年来出现的新型自身抗体

  2、 自身抗体筛选和发现

  新型自身抗体的发现对于疾病诊断和认识具有重要意义。目前以HEp-2细胞为基质的ANA检测及以肝、肾组织为基质的ANCA和GBM检测已经在临床广泛开展[21,22], 而临床实践过程中, 相当数量的医师和技师只关注熟悉已知的荧光抗体模型, 对于特殊少见荧光模型很多情况下都主观认为是非特异性染色或杂质而忽略。实际上, 临床工作中遇到未知荧光抗体模型时应做详细记录, 并结合患者疾病或临床症状进行分析, 从而可能发现新的荧光模型与疾病之间的关系, 有利于新型自身抗体发现。

  此外, 传统的Western-blot法也是发现新型自身抗体的检测方法。由于ENA抗原蛋白分离带非常多, 临床上会发现一些所谓的“杂带”, 这些杂带可能就是与疾病相关的新型自身抗体, 但临床实践中也常被忽略。目前, 由于该法检测ENA抗体谱的局限性, 以及检测结果的不确定性, Western-blot法检测ENA抗体谱已很少使用, 取而代之采用纯化抗原的线性免疫印迹法、化学发光法或液相芯片技术进行检测。

  虽说上述两种方法具有发现新型自身抗体的可能性, 但荧光抗体检测基质及ENA提取物抗原种类有限, 基质并未包括人体所有的抗原物质, 这是发现新型自身抗体的内在缺陷。目前已发展出一些高效筛选自身抗体的方法。

  2.1、 重组cDNA表达文库的血清学分析 (SEREX)

  SEREX技术是自身抗体筛选的重要手段, 通过提取患者组织mRNA反转录成cDNA后导入噬菌体, 并溶原性感染大肠杆菌构建cDNA表达文库, 将表达产物转印在硝酸纤维膜上, 之后与患者血清反应, 然后对阳性克隆进行PCR测序鉴定即可得知抗原种类, 同时也选出相应的自身抗体。

  2.2、 噬菌体展示技术

  噬菌体展示技术是将外源基因插入噬菌体衣壳蛋白基因, 使外源蛋白表达在噬菌体表面, 大量表达外源蛋白的单个噬菌体构成噬菌体文库, 展示的蛋白和血清中IgG自身抗体反应后, 筛选阳性噬菌体并扩增鉴定, 并采用测序方式确定自身抗原。

  2.3、 蛋白芯片技术

  首先, 纳入一定数量的研究患者及匹配的对照, 从而寻找患者与对照最为显着差异表达的信号, 之后将选定的差异自身抗体在大范围患者确认, 以确定选定自身抗体诊断疾病的有效性。目前, 众多学者已尝试采用约20 000个重组人蛋白的芯片, 系统性地发现免疫相关疾病及肿瘤的自身抗体[23]。

  3、 自身抗体检测新技术

  二十世纪50年代中期至80年代后期的30余年间, 自身抗体的检测方法主要有间接免疫荧光法、放射免疫法、被动血凝法、颗粒凝集法、对流免疫电泳法、免疫双扩散法、放射免疫沉淀法、免疫印迹法等, 主要从细胞及蛋白多肽水平认识自身抗体。对于上述检测方法而言, 鉴于间接免疫荧光法检测结果的直观性、自身抗体检测的广泛性, 在今后一段时间内, 该方法仍将是不可替代的筛选检测方法。

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关键词:自身抗体 标准化操作 筛选技术 展望 

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