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血流感染病原微生物的检测技术探析

时间:2019-07-01 19:05  点击: 次  来源:网络  作者:佚名  评论:- 小 + 大

  摘    要: 血流感染 (BSI) 是指病原微生物侵入血液循环并在体内繁殖的一种全身感染性疾病。近年来因其高发病率及病死率而受到越来越多的关注, 如何实现BSI致病菌的快速检测及其药敏结果的准确回报, 是长期困扰临床的问题。血培养是诊断BSI病原微生物的“金标准”, 但其阳性率低且结果报告周期长, 因此需探索新的技术以弥补此缺陷。近年来, 微生物多种诊断技术, 如阳性报警时间、核酸杂交技术、核酸扩增技术、质谱检测技术、基因芯片和测序技术等逐步从研究阶段走向BSI病原微生物诊断的临床应用阶段。本文旨在对BSI病原微生物基于全血标本和基于血培养的检测技术进行综述, 为BSI病原微生物快速诊断和治疗提供方法学依据。

  关键词: 血流感染; 血培养; 诊断技术; 病原菌; 病原微生物;

  Abstract: Bloodstream infection (BSI) is a systemic infectious disease in which pathogenic microorganisms invade in the blood circulation and reproduce in vivo.In recent years, more and more attention has been paid to BSI due to its high morbidity and mortality, and how to realize the rapid detection of pathogenic bacteria in BSI and the accurate return of their drug sensitivity results is a long-term clinical problem.Blood culture is the "gold standard" for the diagnosis of pathogenic microorganisms in BSI, but the positive rate is low and the reporting period is long.Therefore, new techniques need to be explored to remedy this defect.In recent years, many diagnostic techniques of microorganisms, such as positive alarm time, nucleic acid hybridization, nucleic acid amplification, mass spectrometry, gene chip and sequencing technology, have gradually moved from the research stage to the clinical application stage of BSI pathogenic microorganism diagnosis.The purpose of this paper is to review the detection techniques of BSI pathogenic microorganisms based on whole blood samples and blood culture, and to provide methodological basis for rapid diagnosis and treatment of BSI pathogenic microorganisms.

  Keyword: bloodstream infection; blood culture; diagnostic techniques; pathogenic bacteria; pathogenic microorganisms;

  血流感染 (BSI) 是一种发病率及病死率高的病原微生物全身感染性疾病[1]。研究表明, 延迟、不足或不适当的抗感染治疗与BSI患者病死率增加有关[2]。虽然在感染24h内经验性治疗能改善患者预后, 但可导致耐药菌的出现和传播, 并增加侵袭性真菌感染的机会[3]。因此, 正确且及时的抗感染治疗对患者的生存和抑制病原微生物的耐药性至关重要。BSI病原微生物的快速鉴定和药敏试验是临床微生物实验室最重要的任务之一, 对于BSI病原微生物快速鉴定、药敏技术的研究及临床应用应引起检验人员的高度关注。本文讨论了病原微生物诊断的最新技术研究, 为促进BSI的诊断和治疗提供新的视角。

  1、 基于血培养的病原微生物检测技术

  血培养仍然是BSI病原微生物诊断的“金标准”, 但血培养仪阳性报警后, 需分离纯化病原微生物进行鉴定和药敏试验, 因而导致报告结果周期长。目前, 已有较多方法可快速鉴定阳性血培养中的病原菌, 这些检测方法简化了常规血培养的工作流程, 缩短了结果报告时间。

血流感染病原微生物的检测技术探析

  1.1、 阳性报警时间 (TTP) 的应用

  TTP是指从血培养瓶放入监测系统到仪器报告阳性的时间。根据不同微生物在血培养瓶中生长速度的快慢, 利用TTP可初步推断微生物的类型。谢香梅等[4]统计大肠杆菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、肠球菌、链球菌及真菌等各有不同的TTP, 结合革兰染色可对BSI病原微生物类型进行初步鉴定。同时TTP对于鉴别分离菌株是否为污染菌具有一定的参考价值, 朱珠等[5]对1 300例BSI分离菌株的TTP、实验室数据及临床资料进行综合分析, 并将这些细菌分为感染菌组与污染菌组, 两组比较TTP差异有统计学意义 (P<0.05) 。根据血培养瓶TTP的早晚可对病原微生物进行初步鉴定或判断是否存在污染菌的情况等受诸多因素的影响, 如抗菌药物的使用、标本含菌量、取样时间、取样量等, 因此其在临床的应用仍有待于不断研究。

  1.2 、显色培养基

  显色培养基是根据微生物自身代谢产生酶的特征而设计的一种分离培养基, 通过直接观察菌落颜色即可对菌株做出鉴定。目前, 除了针对沙门菌、念珠菌属、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、艰难梭菌、弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌等的特殊显色培养基外, 还有用于筛选耐药性病原菌的显色培养基, 如耐万古霉素肠球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 、耐超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶的肠杆菌等。将自动血培养仪与涂片镜检、显色培养基结合起来, 可缩短对血培养中阳性病原菌检测时间。陈荣等[6]采用显色培养基检测血培养中MRSA, 结果提示该方法与实验室常规鉴定方法及聚合酶链反应 (PCR) 检测结果的符合率高, 特异度为98.8%, 灵敏度为97.9%, 同时该方法将实验室诊断MRSA BSI的平均报告时间提前1d。

  1.3 、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)

  MALDI-TOF MS是依据微生物生物标志蛋白各自特异度肽质量指纹图谱的不同, 通过与商业化的参考数据库进行比对, 进而确定待测微生物的种属。该技术对阳性血培养中病原菌分离纯化后进行鉴定仅需几分钟, 并且对临床常见细菌鉴定准确率达到90%~95%[7]。对从阳性血培养中病原菌不分离纯化直接鉴定而言, 也仅需几十分钟, 但该方法仍需探索以提高检测的准确性。马坚等[8]采用MAL-DI-TOF MS直接检测312份阳性血培养中病原菌, 与常规方法比较, 属水平鉴定符合率仅为84.0%, 种水平符合率为64.7%, 对革兰阳性菌鉴定准确率不佳且低于革兰阴性菌。MALDI-TOF MS对检测病原菌耐药性也有潜在的帮助, 如检测β-内酰胺酶或碳青霉烯类耐药菌、检测金黄色葡萄球菌耐药基因及毒力因子以及区分万古霉素敏感和万古霉素耐药肠球菌等[3]。尽管MALDI-TOF MS现已成为临床实验室鉴定微生物的有效工具, 但依然存在诸多问题, 如病原菌肽质量指纹图谱重复性问题、质谱数据库亟待完善及细菌耐药性研究应用于临床等均需要进一步改进和完善。

  1.4、 荧光原位杂交 (FISH) 技术

  FISH是一种利用荧光标记探针对不同病原微生物的rRNA分子进行靶向杂交的技术。该技术可用于金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌属、链球菌属、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、布鲁菌属和真菌等微生物的检测。目前已有较多商业性试剂盒可用于直接鉴定阳性血培养中特定病原菌, 如PNA-FISH? (AdvanDx) 、Quick FISH? (AdvanDx) 、The AccuProbe system? (Hologic) 、Accelerate DiagnosticsTM (Arizona) 等, 这些均可在数小时内完成阳性血培养分离菌株的检测, 检测的灵敏度和特异度可达到96%~100%[9]。一项多中心研究中, 用肽核酸荧光原位杂交法 (PNA-FISH) 检测阳性血培养中分离的355株肠球菌, 检测特异度和灵敏度分别为100%和97%[10]。尽管该技术在阳性血培养病原微生物检测中表现出较好的应用前景, 但可用的特异度探针数量有限, 一些微生物只能在属的水平上鉴定, 并且缺乏所鉴定微生物的抗菌药物敏感信息。

  1.5、 核酸扩增技术

  核酸扩增技术是一种体外扩增核酸片段的技术, 以PCR技术最为常用, 可从血液或阳性血培养中直接进行病原微生物鉴定及耐药基因的检测, 具有较高的特异度和灵敏度[11]。该技术通常是使用特异引物扩增病原微生物目标基因或使用通用引物扩增细菌 (16S/23S) 或真菌 (18S) 基因组的保守rRNA区域, 随后对扩增产物进行凝胶电泳、高分辨率熔解曲线、微阵列杂交或基因测序等分析。MASEK等[12]使用PCR方法联合高分辨率熔解曲线分析有效地检出BSI中沙门菌。MOORE等[13]检测1 130份疑似菌血症患者血样, 采用PCR扩增病原菌16S和/或23SrRNA, 然后进行焦磷酸测序, 该方法与传统培养法的一致性为96.9%, 灵敏度为77.8%, 特异度为99.3%。

  由PCR衍变相关核酸扩增技术也广泛用于BSI病原微生物检测, 如实时荧光PCR技术、多重PCR技术和环介导等温扩增技术 (LAMP) 等。这些方法提高了PCR的灵敏度、特异度和检测速度, 更有利于BSI中多重病原微生物的检测, 同时也可对常见耐药基因检测, 如mecA、vanA/B、vanC1/C2/C3、blaKPC、blaNDM-1、blaVIM或blaIMP等。胡翀等[14]采用多重PCR法鉴定200份阳性血培养标本, 约4h可完成细菌鉴定, 与传统血培养法结果符合率为100.0%;任春阳等[15]应用环介导等温扩增技术直接检测300份阳性血培养瓶中大肠埃希菌, 检出时间约1h, 与传统培养法比较, 灵敏度和特异度均达100.0%。

  目前, 已有较多基于PCR技术的商业性平台应用于阳性血培养中病原微生物鉴定及耐药基因的直接检测, 如 (bioMérieux, France) 、The MRSA/SA BC assay (Cepheid, USA) 、BD MaxTM StaphSR Assay (BD, Canada) 、Minus (Momentum Bioscience, UK) 和 (Amplex ByoSistems GmbH, Germany) 等。虽然这些商业性平台提高了检测速度, 但仍然无法摆脱PCR方法的局限性, 如血液中PCR抑制剂及污染物DNA或死亡微生物的DNA的存在等影响检测结果;在病原菌未明的情况下, 难以做到逐一检测用于BSI多重病原菌感染的诊断。其次, 在国内实验室推广应用上也受多种因素限制, 如基层实验室条件限制、PCR试剂盒诊断价格和某些技术平台国内批准文号等。

  1.6 、基因芯片 (DNA微阵列)

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关键词:血流感染 血培养 诊断技术 病原菌 病原微生物 

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