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维甲酸对小鼠胚胎生长发育的影响分析

时间:2019-06-07 10:00  点击: 次  来源:好文学  作者:编辑  评论:- 小 + 大

  摘    要: 维甲酸是动物体内维生素A的代谢中间产物, 在脊椎动物生长发育, 尤其是胚胎发育过程中有重要作用。研究了维甲酸在不同剂量及不同胚胎发育时间点对骨骼发育的影响, 并通过检测Cyp26b1基因的表达水平初步探究了维甲酸致畸作用的机制。结果显示, 维甲酸导致的骨骼致畸程度与剂量呈依赖关系;孕期内维甲酸暴露时间不同, 致畸部位也不同;维甲酸能够引起胎鼠Cyp26b1基因的表达下降。维甲酸暴露可导致骨骼发育畸形, 这一作用可能是通过Cyp26b1基因的表达变化引起的。

  关键词: 维甲酸; 胎鼠; 致畸性; Cyp26b1基因;

  Abstract: Retinoic acid is a metabolic intermediate of vitamin A in animals. It plays an important role in the growth and development of vertebrates, especially in embryonic development. In this study, the effects of retinoic acid on skeletal development at different doses and different embryonic time were studied. The expression level of Cyp26 b1 gene was further detected to explore the mechanism of teratogenicity. The results showed that the degree of teratogenicity of skeletons was dose-dependent, and the teratogenic sites of skeletons varied with exposure time. Retinoic acid could cause decrease of the expression level of Cyp26 b1 gene. Retinoic acid can lead to skeletal malformation, which may be caused by the expression changes of Cyp26 b1 gene.

  Keyword: retinoic acid; fetal rat; teratogenicity; Cyp26b1 gene;

  维生素A (vitamin A) 又称视黄醇, 是脊椎动物胚胎时期细胞增殖、生长和分化的重要信号分子。动物通过食物摄入维生素A, 并经过两步脱氢氧化为维甲酸 (retinoic acid, RA) , 维甲酸在生物体内异构酶的作用下以全反式维甲酸 (alltrans retinoic acid, ATRA) 和顺式维甲酸 (cis-retinoic acid, cis-RA) 的形式存在[1,2]。研究表明, 全反式维甲酸能够诱导成骨细胞、骨髓基质细胞、干细胞等细胞的分化以及骨代谢相关基因的表达, 参与骨骼的发育与代谢[3]。当其缺乏时, 它会破坏成骨细胞与破骨细胞之间的平衡, 引起骨质增殖或骨质不吸收, 孕妇如果缺乏维甲酸会直接影响胎儿发育, 甚至发生死胎[4]。然而在1953年, Cohlan[5]报道了孕鼠摄入过多维生素A导致胎鼠露脑等多种畸形。随后的实验研究也证实, 过量的维甲酸对脊椎动物以及胎儿有致畸作用[6,7,8]。已有研究发现不同剂量的维甲酸对小鼠胎鼠的致畸效果不同[9,10]。然而关于不同孕期维甲酸诱导的胎鼠畸形的机理研究较少, 且不同的学者对于维甲酸引起骨骼畸形的代谢机理观点不尽一致, 因此本文探究了不同剂量、不同孕期维甲酸对小鼠胚胎生长发育的影响, 并试图从基因层面初步探究维甲酸的致畸机理。

维甲酸对小鼠胚胎生长发育的影响分析

  1、 材料与方法

  1.1、 实验动物

  ICR小鼠购于浙江省实验动物中心, 经饲养观察3 d后用于实验;实验动物实验程序按本校实验动物伦理规范 (2013051201) 执行。

  1.2、 主要试剂与仪器

  全反式维甲酸购于上海第六制药厂, 批号 01007;阿利新蓝、茜素红购于Amresco公司; RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒购于Bio-Rad公司;橄榄油购于中粮集团;甘油、丙酮等购于国药集团, 分析纯。

  主要仪器:体式显微镜 (Nikon, 日本) ;台式高速低温离心机 (Sigma, 德国) ;荧光定量PCR仪 (Bio-Rad, 美国) 。

  1.3 、方法

  1.3.1、 维甲酸对胎鼠的致畸作用

  ①不同剂量的维甲酸对胎鼠的致畸作用。取孕鼠16只, 随机分成4组, 设置3个实验组 (ATRA-橄榄油悬液, 灌胃) 和1个溶剂对照组 (橄榄油, 灌胃) 。实验组在小鼠妊娠11.5 d 分别灌胃10 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的ATRA-橄榄油悬液。在怀孕18.5 d, 剖腹, 取出胚胎, 染色并测定相关指标。

  ②维甲酸对不同孕期的小鼠胚胎的致畸作用。取孕鼠16只, 随机分成4组, 设置3个实验组 (ATRA-橄榄油悬液, 灌胃) 和1个溶剂对照组 (橄榄油, 灌胃) 。实验组分别在小鼠怀孕的7.5 d、11.5 d 和 15.5 d 以50 mg/kg的剂量灌胃ATRA-橄榄油悬液。在怀孕18.5 d, 剖腹, 取出胚胎, 染色并测定相关指标。

  1.3.2、 胎鼠骨骼染色

  取胎鼠, 95%酒精固定45 min, 去除全身皮肤、皮下脂肪、内脏, 重新置于95%酒精中固定36 h。然后置于丙酮中脱脂36 h, 将脱脂后的标本分别置于0.017%茜素红、0.025%阿利新蓝中, 37℃各染色1 d。将染色后的骨骼置于20%甘油中平衡1 h, 再置于20%甘油与1% KOH混合的透明液中透明3 d。标本保存于20%甘油中[11,12], 体式显微镜下观察骨骼发育情况, 测量骨骼长度。

  1.3.3、 胎鼠的RNA提取与RT-PCR

  按照试剂盒提取胎鼠总RNA, 逆转录合成cDNA, 以cDNA为模板进行荧光定量扩增。PCR的反应条件:95℃预变性3 min;95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 40个循环。以GAPDH (上游引物:5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′, 下游引物:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′) 为内参基因, 分析Cyp26b1 (上游引物:5′-CTGGCTGCTACAGGGTTCTG-3′, 下游引物:5′-CTCGCCCATGAGGATCTTGC-3′) 基因的表达水平。

  1.3.4、 统计学处理

  采用SPSS 21.0软件进行数据分析, 实验结果用xˉ±sxˉ±s表示, 采用单因素方差分析, P<0.05具有统计学差异。

  2、 结果与分析

  2.1、 不同剂量维甲酸对胎鼠四肢骨骼发育的影响

  2.1.1、 不同剂量维甲酸对胎鼠四肢长骨发育的影响

  由图1可见, 在怀孕第11.5 d灌胃不同剂量的维甲酸对小鼠体内胎鼠的致畸作用主要表现在四肢骨骼上。胎鼠四肢长骨均普遍短于对照组, 并且随维甲酸剂量的升高不断缩短 (图1A) , 这说明维甲酸对小鼠四肢骨骼发育有抑制作用。并且维甲酸对胎鼠长骨的成骨部分抑制影响尤为剧烈, 随着维甲酸剂量的升高, 四肢长骨的成骨部分缩短明显 (图1A、B) 。在维甲酸作用下, 小鼠的桡骨、尺骨、股骨、胫骨、腓骨均表现出成骨骨化缺失 (图1B、C) , 这表明维甲酸对胎鼠四肢骨骼发育的抑制作用主要影响骨骼的骨化过程。

  2.1.2、 维甲酸对胎鼠四肢手 (足) 骨发育的影响

  由图2可见, 在怀孕第11.5 d灌胃不同剂量的维甲酸, 对小鼠四肢手 (足) 骨发育的统计, 手指骨和足趾骨影响较大 (图2B) , 伴随着维甲酸作用剂量的上升, 胎鼠指 (趾) 骨的分化逐渐减弱 (图2A) , 当灌胃量达到50 mg/kg以上时, 出现少指 (趾) 、并趾、跗骨缩短甚至愈合的现象 (图2B) , 这说明在孕期11.5 d, 一定剂量的维甲酸可以干扰骨骼的分化。

  图1 不同剂量维甲酸对胎鼠四肢长骨发育的影响

图1 不同剂量维甲酸对胎鼠四肢长骨发育的影响

  Fig.1 The effects of different doses of ATRA on long bone of limbs in fetal rat.

  A.不同剂量维甲酸作用下小鼠整体骨骼、四肢骨骼染色图 (1为肱骨, 2为桡骨和尺骨, 3为股骨, 4为胫骨和腓骨, 红色代表成骨, 蓝色代表软骨) ;B.不同剂量维甲酸作用下小鼠长骨 (肱骨、桡骨、尺骨) 的成骨长度;C.不同剂量维甲酸作用下小鼠长骨 (股骨、胫骨、腓骨) 的成骨长度。*与**表示, 对照组相比在P<0.05和P<0.01水平上差异显着。

  图2 不同剂量维甲酸对胎鼠四肢指 (趾) 骨发育的影响

图2 不同剂量维甲酸对胎鼠四肢指 (趾) 骨发育的影响

  Fig.2 The effects of different doses of ATRA on bone of fingers and toes in fetal rat.

  A.畸形趾骨 (1为少趾, 2为并趾, 3为跗骨缩短或愈合) ;B. 不同灌胃剂量对胎鼠指 (趾) 数的影响;C. 不同灌胃剂量对胎鼠跗骨长的影响。**表示与对照组 (0 mg/kg组) 相比在P<0.01水平上差异显着。

  2.2、 维甲酸对不同孕期胎鼠骨骼发育的影响

  由图3可见, 在小鼠的不同孕期, 维甲酸对胎鼠的致畸程度不同。在孕7.5 d, 维甲酸可引起胎鼠尾椎缩短变形或无尾椎、胸肋骨发育异常等现象 (图3B) ;在孕11.5 d, 维甲酸主要使胎鼠四肢骨骼发育迟缓, 出现四肢长骨的成骨缩短或消失, 并抑制指 (趾) 骨分化;在孕15.5 d, 维甲酸对骨骼的致畸作用弱于7.5 d 和11.5 d, 但也能在一定程度上使胎鼠四肢长度缩短, 指 (趾) 个数减少, 并且影响成骨的骨化。 (图3B~E) 。

  图3 维甲酸对不同孕期小鼠骨骼发育的影响

图3 维甲酸对不同孕期小鼠骨骼发育的影响

  Fig.3 The effects of ATRA on bones in different pregnancy time of mice.

  A.小鼠整体骨骼染色图;B.不同孕期维甲酸的致畸作用, 1为胸肋骨异常, 2为尾椎消失, 3为桡骨、尺骨缩短, 4为后肢发育异常, 5为成骨骨化不完全;C、D、E.灌胃时间对胎鼠尾长、前后肢长、指 (趾) 数的影响。**表示与对照组相比在P<0.01水平上差异显着。

  2.3、 维甲酸对胎鼠 Cyp26b1基因表达水平的影响

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关键词:维甲酸 胎鼠 致畸性 Cyp26b1基因 

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